В последнее десятилетие вырос спрос на безглютеновые продукты, и поэтому их все чаще можно найти на прилавках магазинов. Число потребителей, которые испытывают проблемы с перевариванием клейковины выросло примерно до 10%. Эти люди показывают различную степень чувствительности к глютену, но их состояние в целом улучшается при соблюдении безглютеновой диеты. Кроме того, среди все большего числа потребителей растет понимание того, что для них предпочтительнее безглютеновая диета.
Тенденция использования трех различных диет в США в период с 2004 года по май 2012 года.
"Для американского населения в целом переход на безглютеновую диету становится все более популярным. Рынок безглютеновых продуктов питания и напитков рос ежегодно на 28% с 2004 по 2011 год. Опередив в 2008 году диету с низким содержанием углеводов и безжировую диету, он достиг уровня розничных продаж почти в 1,6 млрд. долларов в 2010 году. К 2012 году розничный оборот по прогнозам составит около 2,6 млрд. долларов. Тот факт, что около трех миллионов американцев страдают от целиакии и лишь часть этих пациентов были диагностированы, говорит о том, что пациенты, страдающие от других форм доказанной реакции на клейковину (включая чувствительность к глютену и аллергию на пшеницу), вносят вклад в рост этого рынка. Остальная часть рынка заполнена случайными потребителями (без медицинской необходимости) или людьми с заболеваниями, которые, как считается, зависят от наличия глютена в пище (аутизм, синдромом дефицита внимания с гиперактивностью, рассеянный склероз и синдром раздраженного кишечника и т.д.), но для которых отсутствуют доказательства эффективности безглютеновой диеты." Источник: Sapone et al., Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classification., BMC Medicine 2012 10:13.
Что такое глютен? Почему он может быть токсичным? И как глютен может быть обнаружен в пище?
Что такое глютен?
Термин "глютен" (синоним: клейковина) происходит от латинского слова glue (клей), и этим словом обозначают целый ряд белков, называемых проламинами и глютелинами, которые содержатся в пшенице, ячмене, ржи, овсе и их гибридах. Термином "проламины" обозначают фракцию, которую можно извлечь с помощью 40-70% этанола, и эта фракция, в зависимости от вида зерна, носит название глиадин, гордеин, секалин либо авенин. В целом, проламины и глютелины присутствуют в клейковине примерно в равной пропорции.
Во всем мире клейковина является важным источником пищевых белков ‑ как в продуктах, приготовленных непосредственно из источников глютена, так и в качестве добавки к пище с низким содержанием белка. Благодаря своим физико-химическим свойствам клейковина отвечает за текстуру и форму пищевых продуктов. При замешивании с водой клейковина образует вязкоупругое тесто с особой белковой сеткой, которая отвечает за форму хлебобулочных изделий.
Номенклатура и классификация расстройств, связанных с глютеном
Целиакия
С началом перехода от охоты и собирательства к аграрному укладу жизни 10 000 лет тому назад хлебные злаки стали главной составляющей рациона человека. В связи с этим возникает вопрос: почему в настоящее время глютен приносит все возрастающие проблемы со здоровьем? Приблизительно 1% мирового населения страдает от целиакии ‑ иммунной энтеропатии, вызываемой глютеном в пище. Интересно, что целиакия встречается чаще у женщин, чем у мужчин. Симптомы разнообразны и не ограничиваются желудочно-кишечного трактом. Это может быть не только понос, боль в животе, метеоризм, расстройство желудка или потеря веса, но и раздражительность, депрессия и тревожность. Тем не менее, все эти симптомы считаются ненадежными индикаторами целиакии. Целиакия может быть диагностирована методом скрининга определенных антител в сыворотке крови. Еще один рекомендуемый метод диагностики ‑ это биопсия слизистой оболочки и тонкого кишечника с целью подтверждения их поражения, поскольку это заболевание приводит к разрушению микроскопических пальчикообразных выростов в тонком кишечнике, которые называются ворсинками. Поскольку кишечные ворсинки ответственны за усвоение питательных веществ, то недоедание становится проблемой, которая со временем может привести, среди прочих проблем, к задержке развития, остеопорозу или дефициту питательных веществ. Целиакия ‑ это генетически обусловленные аутоиммунные расстройства, при которых иммунная система неправильно реагирует на пищевой глютен. Фермент под названием "тканевая трансглутаминаза" деаминирует пептиды глютена с образованием Т-клеточных эпитопов. Это стимулирует иммунную систему и перекрестные реакции с тканями тонкого кишечника, вызывая воспалительную реакцию, которая приводит к усечению ворсинок. За такие иммунные реакции ответственны в основном белки проламины. Самый сильный ответ направлен на альфа-2-глиадиновый фрагмент, который состоит из 33 аминокислот и дает главный вклад в иммунотоксичность глютена. Этот, так называемый 33-mer, обладает высокой устойчивостью к расщеплению пищеварительными ферментами и, следовательно, является подходящей молекулой для использования в качестве аналитического маркера. Были обнаружены гомологи в зерновых культурах, которые токсичны для больных целиакией, но отсутствуют в нетоксичных злаках.
Единственным эффективным методом лечения целиакии до сих пор является пожизненное соблюдение безглютеновой диеты. Это нелегко, поскольку клейковина очень распространена в продуктах питания. "Скрытый" глютен, который добавляют в качестве белкового наполнителя, можно найти в таких неожиданных продуктах, как лекарственные препараты, колбасы, соусы и десерты. Кроме того, безглютеновые продукты могут содержать глютен вследствие перекрестного загрязнения, которое может произойти в процессе шлифования зерна, хранения и производства. Безглютеновые продукты, как правило, включают рис, кукурузу и гречку, а также очищенный крахмал, который все еще содержит небольшое количество клейковины. Очень трудно установить допустимые пределы, поскольку чувствительность к глютену варьируется от человека к человеку. Согласно научным исследованиям суточное потребление клейковины должно составлять менее 50 мг.
Законодательство и стандарты
Комиссия по качеству пищевых продуктов в конце 1970-х годов приступила к обсуждению рекомендаций по допустимым пределам, создав в 2008 году Стандарт кодекса по диетическим пищевым продуктам для людей с непереносимостью глютена (CODEX STAN 118 - 1979). Эта рекомендация была принята в европейском законодательстве в Регламенте Комиссии (EC) № 41/2009 от 20 января 2009 г. "О составе и маркировке пищевых продуктов, пригодных для людей с непереносимостью глютена". В отличие от других пищевых аллергенов, пороги были определены. Продукты питания, помеченные как безглютеновые, должны содержать не более 20 ppm глютена, а продукты с низким содержанием клейковины - менее 100 ppm. В США правила маркировки безглютеновых продуктов питания находятся в стадии подготовки.
Анализ глютена
Поскольку существует много регламентов, назрела необходимость в применении соответствующих методов обнаружения глютена в пище. В настоящее время доступно несколько технологий (с разной степенью коммерциализации) для проведения качественных и количественных определений: тесты с использованием специфических антител, например, иммуноферментный анализ (ИФА) или горизонтальный проточный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и новые методы, такие как масс-спектрометрия. Предпочтительно, чтобы аналитические тест-системы могли выявлять эпитопы, которые участвуют в целиакии.
Тот факт, что клейковина представляет собой сложную смесь белков, которые присутствуют в широком диапазоне матриц как обработанных, так и необработанных пищевых продуктов, создает огромную проблему с точки зрения правильного количественного определения и подбора подходящего стандартного образца. В 1985 году в Европе была основана Рабочая группа по проламинам (PWG). Одной из ее задач было создание признанных стандартов глютена - и, соответственно, глиадина. Им удалось получить стандартные образцы путем извлечения глиадинов из наиболее распространенных сортов пшеницы. IRMM (Институт стандартных материалов и измерений) первоначально утвердил глиадин PWG в качестве сертифицированного стандартного материала, но позже отозвал свое решение. Тем не менее, глиадин PWG по-прежнему остается единственным стандартным материалом, который получил какое-то признание и широко использовался для калибровки тест-систем.
Иммуноферментный анализ (ИФА) - рекомендованный метод для определения глютена в пище. В настоящее время большое количество наборов для ИФА коммерчески доступны. В иммунологических методах применяются антитела, которые были индуцированы к различным проламиновым фракциям или специфическим последовательностям, которые являются токсичными. Разные тест-наборы не всегда дают одинаковые результаты по ряду причин. Сюда относятся различные особенности используемых поликлональных и моноклональных антител, различные методы извлечения, а также различные материалы для калибровки тестов.
Для тестирования клейковины было разработано много моноклональных и поликлональных антител, но только некоторые из них получили широкое применение. В конце 1980-х годов Скерритт получил новое антитело. Эти моноклональное антитело было индуцировано к глиадину пшеницы из австралийского сорта пшеницы; оно распознает высокомолекулярные глютениновые субъединицы и термостабильные субфракции, называемые омега-глиадинами, что делает антитело Скерритта пригодным для анализа глютена в обработанных пищевых продуктах. Тем не менее, поскольку количественное определение основано на количестве омега-глиадинов, которые различаются у разных видов зерновых, это может вызвать значительные разногласия в результатах. Кроме того, антитело Скерритта дает слабый ответ на гордеин.
Другое моноклональное антитело для обнаружения глютена ‑ антитело R5 ‑ было получено профессором Мендесом в Испании. Антитело R5 было индуцировано к секалину ржи, но показало сильную перекрестную реактивность с глиадином пшеницы. При этом оно также распознает белки из сои и люпина, которые не относятся к токсичным проламинам. Изменение направления поиска от обнаружения проламинов к обнаружению иммунотоксических пептидов, участвующих в патогенезе целиакии, привело к созданию следующего поколения антител. Антитело G12™, которое применяется в ИФА-тесте AgraQuant® Gluten G12™ и в иммунохроматографическом тесте AgraStrip® Gluten G12™, принадлежит к следующему поколению.
Новое поколение анализов на глютен
Антитело G12™ специфично распознает 33-mer белка глиадина, присутствующего в клейковине. Этот токсичный фрагмент был идентифицирован в Университете Стэнфорда и описан в журнале Science в 2002 году. На основании этой публикации, к 33-mer пептиду было индуцировано антитело G12™, которое распознает гексапептидную последовательность QPQLPY и подобные пептиды, найденные в ячмене, ржи и овсе. В отличие от него, антитело R5 было индуцировано к экстракту секалина, а затем эпитоп, с которым он реагирует, был идентифицирован как пентапептид QQPFP. Различие между этими двумя антителами состоит в том, что антитело G12™ специфично нацелено на токсичный фрагмент, который запускает аутоиммунные реакции у больных целиакией, а не на пептидную последовательность, не связанную с клиническими исходами. Это было подтверждено в ходе валидационных исследований, которые показали, что G12™ не дает ложноположительных результатов с соей и, следовательно, подходит для измерения глютена в продуктах, содержащих сою. Также не наблюдается перекрестной реактивности с кукурузой или рисом.
Продолжаются споры о том, безопасен ли овес. В ряде публикаций пришли к выводу, что некоторые сорта овса могут вызывать аутоиммунные реакции у больных целиакией. В процессе валидации ИФА-теста AgraQuant® Gluten G12™ и теста методом бокового проточного анализа AgraStrip® Gluten G12™ наблюдались положительные и отрицательные ответы на сорта овса. По всей видимости, положительные результаты обусловлены специфической реакцией антитела с токсичным фрагментом, но не неспецифическим ответом. Таким образом, с помощью антитела G12™ можно пролить новый свет на эту дискуссию посредством определения тех сортов овса, которые запускают отклик у больных целиакией. В частности, Испанская ассоциация целиакии недавно вручила 6-ю Национальную премию за исследования целиакии группе ученых, которые использовали антитело G12™ для выявления сортов овса с низким содержанием клейковины.
Заключение
От правильной маркировки безглютеновых продуктов зависит здоровье людей, страдающих целиакией. Обеспечение безопасности пищевых продуктов ‑ сложная задача, поэтому исследования по разработке методов обнаружения глютена продолжаются. Результаты новых иммунохимических тестовых систем на основе антитела G12™ следует считать практически идеальными для тестов на пищевую безопасность, поскольку установлена связь между целиакией и присутствием иммунотоксических пептидов.